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基因甲基化概念

甲基化是指从活性甲基化合物(如 S-腺苷基甲硫氨酸)上将甲基催化转移到其他化合物的过程。可形成各种甲基化合物,或是对某些蛋白质或核酸等进行化学修饰形成甲基化产物。在生物系统内,甲基化是经酶催化的,这种甲基化涉及重金属修饰、基因表达的调控、蛋白质功能的调节以及核糖核酸(RNA)加工。
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释义
甲基化是指从活性甲基化合物(如 S-腺苷基甲硫氨酸)上将甲基催化转移到其他化合物的过程。可形成各种甲基化合物,或是对某些蛋白质或核酸等进行化学修饰形成甲基化产物。在生物系统内,甲基化是经酶催化的,这种甲基化涉及重金属修饰、基因表达的调控、蛋白质功能的调节以及核糖核酸(RNA)加工。 [1]

类型
甲基化包括 DNA 甲基化或蛋白质甲基化
(1)DNA 甲基化。脊椎动物的 DNA 甲基化一般发生在 CpG 位点(胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤位点,即 DNA 序列中胞嘧啶后紧连鸟嘌呤的位点)。经 DNA 甲基转移酶催化胞嘧啶转
化为 5-甲基胞嘧啶。人类基因中约 80%-90%的 CpG 位点已被甲基化,但是在某些特定区域,如富含胞嘧啶和鸟嘌呤的CpG岛则未被甲基化。这与包含所有广泛表达基因在内的56%的哺乳动物基因中的启动子有关。1%-2%的人类基因组是 CpG 群,并且 CpG 甲基化与转录活性成反比。

(2)蛋白质甲基化。蛋白质甲基化一般指精氨酸或赖氨酸在蛋白质序列中的甲基化。精氨酸可以被甲基化一次(称为一甲基精氨酸)或两次(精氨酸甲基转移酶(PRMTs)将两个甲基同时转移到精氨酸多肽末端的同一个氮原子上成为非对称性甲基精氨酸,或者在每
个氮端各加一个甲基成为对称性二甲基精氨酸)赖氨酸经赖氨酸转移酶的催化可以甲基化一次、两次或三次。在组蛋白中,蛋白质甲基化是被研究最多的一类。在组蛋白转移酶的催化下,S-腺苷甲硫氨酸的甲基转移到组蛋白。某些组蛋白残基通过甲基化可以抑制或激活基因表达,从而形成为表观遗传。蛋白质甲基化是翻译后修饰的一种形式。

功能
甲基化是蛋白质和核酸的一种重要的修饰,调节基因的表达和关闭,与癌症、衰老、老年痴呆等许多疾病密切相关,是表观遗传学的重要研究内容之一。最常见的甲基化修饰有DNA 甲基化和组蛋白甲基化。

DNA 甲基化能关闭某些基因的活性,去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA 构象、DNA 稳定性及 DNA 与蛋白质相互作用方式的改变,从而控制基因表达。研究证实,CpG 二核苷酸中胞嘧啶的甲基化导致了人体 1/3 以上由于碱基转换而引起的遗传病。DNA 甲基化主要形成 5-甲基胞嘧啶(5-mC)和少量的 N6-甲基腺嘌呤(N6-mA)及 7-甲基鸟嘌呤(7-mG)。在真核生物中,5-甲基胞嘧啶主要出现在CpG 序列、CpXpG、CCA/TGG 和 GATC 中。

DNA甲基化是指生物体在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase,DMT) 的催化下,以 s-腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体,将甲基转移到特定的碱基上的过程。DNA 甲基化可基因甲基化的概念

以发生在腺嘌呤的 N-6 位、鸟嘌呤的 N-7 位、胞嘧啶的 C-5 位等。但在哺乳动物中 DNA 甲基化主要发生在 5’-CpG-3’的 C 上生成 5-甲基胞嘧啶(5mC)。在哺乳动物中 CpG 以两种形式存在:一种是分散于 DNA 序列中;另一种呈现高度聚集状态,人们称之为 CpG 岛(CpG island)。在正常组织里,70%~90%散在的 CpG 是被甲基修饰的,而 CpG 岛则往往是非甲基化的(除有些特殊区段和基因外)。正常情况下,人类基因组“垃圾”序列的 CpG 二核苷酸相对稀少,并且总是处于甲基化状态,与之相反,人类基因组中大小为 100-1000bp 左右,富含 CpG 二核苷酸的 CpG 岛则总是处于未甲基化状态,并且 CpG 岛常位于转录调控区附近,与 56%的人类基因组编码基因相关,因此基因转录区 CpG 岛的甲基化状态的研究就显得十分重要。人类基因组序列草图分析结果表明,人类基因组 CpG 岛约为 28890 个,大部分染色体每 1Mb 就有 5-15 个 CpG 岛,平均值为每 Mb 含 10.5 个 CpG 岛,CpG 岛的数目与基因密度有良好的对应关系。DNA 甲基化主要是通过 DNA 甲基转移酶家族来催化完成的。研究人员在真核生物中发现了 3 类 DNA 甲基转移酶(Dnmt1、Dnmt2、Dnmt3a、Dnmt3b).Dnmt1 一种是维持性甲基化酶;Dnmt2 可与 DNA 上特异位点结合,但具体作用尚不清楚;Dnmt3a 和 Dnmt3b 是重新甲基化酶,它们使去甲基化的 CpG 位点重新甲基化,即参与 DNA 的从头甲基化。在哺乳动物的生殖细胞发育时期和植入前胚胎期,其基因组范围内的甲基化模式通过大规模的去甲基化和接下来的再甲基化过程发生重编程,从而产生具有发育潜能的细胞;在细胞分化的过程中,基因的甲基化状态将遗传给后代细胞。由于 DNA 甲基化与人类发育和肿瘤疾病的密切关系,特别是 CpG 岛甲基化所致抑癌基因转录失活问题,DNA 甲基化已经成为表观遗传学和表观基因组学的重要研究内容。

组蛋白甲基化是指发生在 H3 和 H4 组蛋白 N 端 Arg 或 Lys 残基上的甲基化,由组蛋白甲基转移酶介导催化。组蛋白甲基化的功能主要体现在异染色质形成、基因印记、X 染色体失活和转录调控方面。除了存在组蛋白甲基转移酶以外,还发现了去甲基化酶。先前人们认为组蛋白的甲基化作用是稳定而不可逆的,使这种去甲基化酶的发现使组蛋白甲基化过程更具动态性。

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基因甲基化的概念

检测方法
(1) 甲基化特异性的 PCR(Methylation-specific PCR,MSP)
用亚硫酸氢盐处理基因组 DNA,所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不变;随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物,如果用针对处理后甲基化 DNA 链的引物能得到扩增片段,则说明该位点存在甲
基化;反之,说明被检测的位点不存在甲基化。

(2)亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequencing PCR,BSP)
用亚硫酸氢盐处理基因组 DNA,则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计 BSP 引物进行 PCR,在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶,最后对 PCR 产物进行测序就可以判断 CpG 位点是否发生甲基化称为 BSP-直接测序方法。将 PCR 产物克隆至载体后进行测序,可以提高测序成功率,这种方法称为 BSP-克隆测序法。

(3) 高分辨率熔解曲线法(High Resolution Melting,HRM)在非 CpG 岛位置设计一对针对亚硫酸氢盐修饰后的 DNA 双链的引物,这对引物中间的片段包含感兴趣的 CpG 岛。若这些 CpG 岛发生了甲基化,用亚硫酸氢盐处理后,未甲基化的胞嘧啶经 PCR 扩增后转变成胸腺嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不变,样品中的 GC 含量发生改变,从而导致熔解温度的变化。

(4) 基因组直接测序法
基因组直接测序法是过去一直沿用的 DNA 甲基化的研究方法,用 Maxam—Gilbert 化学裂解法对基因组 DNA 进行处理,并以连接介导的 PCR 来放大信号强度,然后进行序列分析。此法是基于 5mC 在标准的 Maxam—Gilbert 胞嘧啶化学裂解反应中不被裂解,故 5mC可通过在测序胶上缺少对应于胞嘧啶降解反应产物的一个条带而得以鉴定。如采用 MnO4- 哌啶法,结果则反之因此在检测5mC时,此两法可提供完全互补的检测信息。该法与LM—PCR结合后,大大降低了对基因组 DNA 的需要量(1~2 ng)。当 5mC 和 C 同时处于不同 DNA
分子上的同一位点时,该位点至少要有 25%的 5mC 才能被 N2H4法检测到;MnO4-法比 N2 H4法更灵敏。因为这两种基因组 DNA 化学修饰法均有抑制 DNA 聚合酶延伸的特性,无须进行 DNA 哌啶裂解就可通过基因组直接测序技术进行甲基化分析。


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